واحد علوم گیاهی و گیاه‌شناسی و مرکز بیولوژی سلول‌های گیاهی دانشگاه کالیفرنیا
ریورساید ـ امریکا
چکیده
تاثیر کمبود رطوبت طولانی مدت در برگردان (ترجمه) mRNA از نظر کمیتی در برگ‌های راسی و پایه‌ای همه گیاهان تنباکو (نیکوتیانا تاباکوم) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. سطح پلی‌زوم (پلی‌ریبوزوم) (شش ریبوزوم با بیشتر در mRNA) به صورت مشخص تحت شرایط آبیاری خوب در برگ‌های راسی بیشتر از برگ‌های پایه‌ای بود. کمبود رطوبت هم در برگ‌های جوان و هم برگ‌های پیرتر موجب یک کاهش فزاینده در سطوح پلی‌زوم‌ها همراه با افزایش در مونوزوم‌های A.S میشود و این مساله نشانه شروع کاهش یافته برگردان است.
علیرغم کاهش کلی در شکل‌گیری پلی‌زوم در 144 ساعت پس از کمبود آب، mRNA پروتئین انتقال اسید لیپید مشهور، مربوط به کمبود آب، با مقدار زیادی از پلی‌زوم‌ها و محتویات LTP افزایش یافته همراه میشود. mRNAی اسموتین، نسخه دیگر استنباط کم رطوبتی نیز در خلال کم رطوبتی طولانی مدت با پلی‌زوم‌های بزرگ همراه میباشد. در مقابل، mRNAهایی که به کدگذاری پروتئین‌های بدون استرس می‌پردازند، پروتئین‌هایی مثل ریبولوز بیس فسفات کربوکسیل/زیر واحدهای کوچک (rbcS) را اکسیژنه کرده و فاکتور آغاز کننده اکاریوتیک (elF4A)4A را که از نظر فراوانی کاهش داده و به سمت پلی‌زوم‌های کوچک و ترکیبات غیرپلی‌زومی متمایل می‌کند و مشخص میشود که شروع برگردان (ترجمه) این mRNAها بوسیله کمبود رطوبت مورد آسیب قرار می‌گیرد. این نتایج نشان می‌دهد که تنظیم برگردان یک وسیله پاسخ تنظیم رطوبت بوده و تناوب برگردان mRNAهای مستقل در برگ‌های با سن مختلف، متمایز و مشخص میباشد.
واژگان کلیدی: پلی‌زوم‌ها، سنتز پروتئینی، ریبوزوم‌ها، تنباکو، برگردان و استرس کمبود رطوبت
مقدمه
پاسخ گیاهان پیچیده به استرس کمبود رطوبت بستگی به شدت (کاهش در پتانسیل آب). دوره استرس، اندام تجزیه و تحلیل شده و سن آن دارد. تغییرات در فشردگی ژن که ممکن است همانند سطح بعد از نسخه‌برداری در سطح نسخه‌برداری تنظیم شده باشد، پاسخ برجسته و معلومی به استرس کمبود رطوبت گیاه میباشد. با این وجود، مکانیزمهایی که در تنظیم فرآیندهای پس از نسخه‌برداری در پاسخ به استرس کمبود رطوبت دخیل هستند، هنوز مشخص و روشن نشده‌اند.
روابط خاص در الگوهای سنتز پروتئینی برگ در پاسخ به استرس کمبود رطوبت در گیاهان بالاتر رخ می‌دهد. بسیاری از مطالعات صورت گرفته، mRNAهای خاصی را شناسایی و معرفی کردهاند که پروتئین‌هایی را که در اثر استرس کمبود رطوبت انباشته می‌شوند، را کدگذاری می‌کنند. انباشته شدن تعدادی از این mRNAها و پروتئین‌هایی که نیاز به استنباط کمبود رطوبت دارند، موجب افزایش محتویات اسید آبسیسیک (ABA) میشود. فقط در مورد تعداد کمی از ژنها شاهد نمایش مستقیم تنظیم نسخه‌برداری تحریک کمبود رطوبت هستیم.
به عنوان مثال، انباشته شده mRNAی le16، باعث کدگذاری پروتئین انتقال لیپید مشهور (LTP) در گوجه میشود که در سطخ نسخه‌برداری و در پاسخ به افزایش سطح ABA در گوجه‌فرنگی تحریک میشود. در مقابل، در نسخه‌برداری هستک ریبولوز، بیس فسفات کربوکسیل/زیربخش‌های کوچک ژن‌های (rbcS) اکسیژنه می‌شوند و انباشتگی به حالت پیوسته mRNAی (rbcS) در پاسخ به کمبود رطوبت، آسیب می‌بیند. تعدادی از اجزای DNAی عمل کننده سیس برای نسخه‌برداری ارتقاء یافته ژنها تحت شرایط کمبود رطوبت مشخص و تعیین شدهاند. علاوه بر مدولاسیون نسخه‌برداری، مکانیزم‌های پس از نسخه‌برداری که ثبات mRNA، برگردان mRNA و برگشت پروتئین را تعیین می‌کنند نیز ممکن است به تنظیم انباشتگی پروتئین تحریک شده بوسیله کمبود آب کمک کند.
در برگ‌های جدا شده از گوجه‌فرنگی، محتویات mRNA(ی) دو ژن نیازمند به ABA و le25 و l-1 آن، بوسیله نسخه‌برداری همانند وقایع بعد از نسخه‌برداری تنظیم می‌گردد. در برگ‌های تنباکو (نیکوتیانا تاباکوم) هم کمبود رطوبت و هم کاربرد ABA، باعث تحریک انباشتگی mRNA اسموتین (osm) میشود، گرچه پروتئین osm در برگ‌ها نامشخص بودند. اینکه آیا این تنظیم در سطح برگردان یا پس از برگردان روی داده است، هنوز مشخص نشده است. نهایتاًٌ اینکه مدارک تنظیم برگردان mRNA در طول خشک‌شدگی و آب‌پوشیس مجدد در خزه مقاوم در برابر خشکیدگی «تورتولا ودورالیس» مشاهده شد.
گزارش‌های قبلی نشان داده بودند که کمبود رطوبت موجب کاهش مشخص در سنتز پروتئینی در نهان‌دانگان میشود. همانطور که به صورت کاهش موثر در سطوح پلی‌زوم به صورت با مدرک مشخص میباشد. چندین استرس غیر زنده شامل محرومیت از اکسیژن و گرما، موجب کاهش در سطح سنتز پروتئیئنی شده و در برگردان انتخابی یک زیرمجموعه از mRNAها تاثیر بگذارد. چون سنتز پروتئین‌های تحریک شده بوسیله استرس تحت شرایط کم رطوبتی صورت می‌گیرد، آن هم علیرغم کاهش در سنتز پروتئین.
ما اینطور درنظر می‌گیریم که برگردان متفاوت mRNAها ممکن است یک ترکیب یا جز از پاسخ استرس باشد. در اینجا ما نشان می‌دهد که استرس کمبود رطوبت گیاهان تنباکوی رشد کرده گلخانه هم باعث تنظیم در سطوح پلی‌زوم‌ها میشود. تجزیه و تحلیل دو mRNAی تحریک شده بوسیله استرس و دو mRNAی تحریک شده توسط استرس مشخص کرد که استرس کم‌رطوبتی موجب تغییراتی در همکاری mRNAهای مستقل با پلی‌زوم‌ها میشود. علاوه بر این تاثیر کمبود رطوبت بر وضعیت برگردان در برگ‌های با سن مختلف کاملاً آشکار بود.
مواد و روش‌ها
درمان کمبود رطوبت
بذرهای تنباکو (نیکوتیانا تاباکوم و سیکونزین 38) به مدت 3 هفته در دمای 24 درجه سانتیگراد با یک دوره نوری 5/13 ساعته در 200μm.ls-1m-2 در یک محفظه رشد، شروع به جوانه‌زدن می‌کند. نهال‌ها را به ظروف 8 لیتری در گلخانه منتقل می‌کنند و آنها را در دمای حدود 26 درجه سانتیگراد نگهداری می‌کنند (طول روز 12 الی 14 ساعت). زمانی که گیاهان در هفته‌های 12 تا 13 دارای تعداد برگ 8 الی 10 عددی از برگ‌های کاملاً باز و غیرپیر شدند، آبیاری قطع میشود.
برگ‌های بالایی (راسی) کاملاً باز شد و هفت یا هشت جفت برگ (پایه‌ای که آنها را هم از بالا به پایین به حساب می‌آوریم) را بعد از 48.82.96.144 ساعت و بعد از 900 ساعت پس از قطع آب می‌چشیم. محتوی آب نسبی (RWC) را با استفاده از برش‌های دایره‌ای شکلی که به قطر 1 سانتیمتر از هر برگ بریده‌ایم، را تعیین می‌کنیم. همانطور که قبلاً توضیح داده داده‌ایم، RWC=[(FW-DW)/(TW-DW)*100]، در حالی که FW عبارت است از وزن تازه، DW وزن خشک، TW وزن برش خورده برگ پس از 24 ساعت شناور بودن در آب. محتویات ABA با استفاده از روش اندازه‌گیری ایمنی رادیویی ABA به صورت رقابتی تعیین میشود. همانطور که توسط آقایان «بری و بیچی» توضیح داده شد.
نمونه‌های بافت‌ها را در نیتروژن مایع، منجمد کرده و در دمای 80- درجه سانتیگراد برای آنالیز RNA، پروتئین و پلی‌زوم بعدی نگهداری می‌کنند. آزمایشات را حداقل سه مرتبه مورد تکرار قرار می‌دهند.
جداسازی RNA کل، پلی‌زوم‌ها و RNA پلی‌زومی
با استفاده از کیت کوچک گیاهی RN آسان، RNA سلولی کل (30μg) از برگ‌های 1/0گرمی راس یا 4/0 گرمی پایه‌ای جداسازی شد. مقدار RNA با اندازه‌گیری مقدار جذب در 260nm تعیین گردید. برای آنالیزهای پلی‌زوم، برگ‌ها را در یک پودر نرم قرار داد و آن را در نیتروژن مایع قرار دادند و یک میلی‌لیتر از نمونه حجمی سلول بسته‌بندی شده در یک میلی‌لیتر از بافر تقطیر، هیدراته کردند (200 میلی‌مول تریس با pH=9، 200 میلی‌مول KCI)، 36 میلی‌مول MgCl2، 25 میلی‌مول اتیلن گلیکول ـ بیس (بتا آمینو اتیل اتر)-N، N، N' و N' تترااستیک اسید (EGTA) و 100 میکرومول و 2 تا مرکاپتو اتانول، 50 میکرومول mL-1 سیکلوهگزیمید، 50 میکروگرم mL-1 کلرآنفیکول، 1% (v/v) تریتول 100-x، 1% (v/v) بریج 35، 1% (v/v) توین-40، 1% (v/v) 40-NP.
بعد از برطرف کردن ضایعات سلولی بوسیله سانتیریفیوژ کردن در g×14000 به مدت 2 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد، 750 میکرولیتر از شناور به داخل 5/4 میلی‌متر (20 تا 60% w/v) گرادیان نیشکر بارگذاری شده و به مدت 90 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد در g×275000 سانتریفیوژ شد.
چگالی عدسی (OD) نمونه‌ها با یک نمایشگر 5-UA و تقسیم کننده شیب 185 مورد اندازه‌گیری قرار گرفت و میزان جذب را از طریق نیشکر در nm254 با یک رقم داخلی ms124 را نشان داد. اطلاعات مقدار جذب به صورت الکترونیکی و با استفاده از یک کارت تحصیل اطلاعات سازگار 8-DAS به دستگاه خروجی کامل کننده اطلاعات واحد نمایشگر 5-UA متصل شده و ثبت می‌گردد. جزئیات مربوط به نرم‌افزار و سخت‌افزار این سیستم در صورت درخواست در دسترس میباشد.
سطوح پلی‌زومی بوسیله محاسبه سطح پروفیل پلی‌زوم بعد از کم کردن خط مبنای شیب OD تعیین می‌گردد (میزان جذب یک شیب بار شده با بافر تقطیر μl750)، سطح هر پروفیل پلی‌زوم، نسبت به یک مقدار مساوی که برای اختلالات در نمونه مورد بارگذاری درنظر گرفته بود، به صورت نرمال درمی‌آید. سطوح مونوزوم‌ها (s80ریبوزوم و یک ریبوزوم در هر نسخه) و پلی‌زوم‌های بزرگ (6 ریبوزوم یا بیشتر در هر نسخه) با محاسبه ارتباطی محدوده‌های پیک تعیین شدند. محدوده‌های مرتبط با تقسیمات مونوزومی و پلی‌زومی بزرگ به عنوان درصدی از محدوده کل تحت پروفیل گزارش می‌شوند.
مرز پایین‌تری مربوط به s40 پیک زیر واحد و مرز بالاتری قسمت تحتانی و کف شیب بود. برای اندازه‌گیری بارگذاری پلی‌زوم، mRNAهای مستقل شیب‌های نیشکر به 13 لوله (400 میکرولیتری) با یک تقسیم کننده شیب تقسیم میشود. با افزودن 80 میکرولیتر از TES [250 میلی‌مول Tris با pH=8، 250 میلی‌مول اسید اتیلن دی آمین تترا استیک (EDTA)، 5% (v/v) سدیم دو دسیل سولفات (SDS)]، RNA از هر تقسیم جدا میشود. استخراج پروتئین با یک حجم مساوی از فنل: کلروفرم، الکل ایزوامیل به نسبت‌های (25:24:1) و جداسازی جسم از محلول 320 میکرولیتری فاز آبکی با اضافه کردن از حجم 3 مول استات سدیم با pH=5/2 و 2 حجم از اتانول 99/99% در دمای 2- درجه سانتیگراد در طول شب صورت می‌گیرد. RNAها را با اتانول 70% شسته و در 30 میکرولیتر از (نمونه‌های برگ راسی) یا 10 میکرولیتر (از نمونه برگ‌های پایه‌ای) از 1/0% (v/v) دی اتیل پیروکربنات (DEPC) فرآوری شده با آب، حل می‌کنیم.
آنالیزهای خشک کردن RNA و پروتئین
برای تجزیه و تحلیل سطوح پروتئینی RBCS, eI4A, OSM, LTP بافت برگی خرد (نرم شده) به مقدار (5/0گرم) در یک میلی‌لیتر از بافر 90-B محتوی [1/0میلی‌مول EDTA، 1 میلی‌مول دیتیوترتیول، 10% (v/v) گلیسرول، 90 میلی‌مول KCI، 2 میلی‌مول سدیم مولیبدیت، 200 میلی‌مول Hepes, KOH با pH=7.6، 5 میلی‌مول فنیل متیل سولفوئیل فلوراید (PMSF)] هیدراته می‌شوند و ضایعات سلولی را بوسیله سانتریفیوژ g×14000 به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد از آن جدا می‌کنیم. غلظت پروتئین با استفاده ازد مقاله پروتئین پیترسوم با آلبومین سرم بووین به عنوان یک استاندارد تعیین می‌کنیم. پروتئین (به مقدار 20 میکروگرم) با بافر نمونه SDS نسبت به غلظت نهایی 5 میلی‌مول Tris با pH=6.8 و 5% (v/v) گلیسرول و 2% (w/v) SDS، 5/0%(v/v) دو مرکاپتو اتانول و 125/0% (w/v) برومو فنول آبی، رقیق کرده و آن را در دمای 100 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه حرارت می‌دهیم و مواد غیرقابل حل را نیز بوسیله سانتریفیوژ جدا می‌کنیم. پروتئین‌ها را بوسیله الکتروفورسیس با استفاده از الکتروفورسیس ژل پبی اکریلامید SDS (PAGE) با [15% (w/v) اکریلامید، 5% (w/v) N'، N'-متیلن ـ بیس ـ الکریلامید، 375 میلی‌مول Tris با pH=8، 1/0% (w/v) SDS، 5/0% (w/v) آمونیوم پرسولفات، 5/0% (v/v) TEMED] تقسیم می‌شوند. غشاها را با آنتی‌سرم ضد LTP پلی‌کلونال خرگوشی مورد تکثیر قرار می‌دهند. همینطور با آنتی‌سرم ضداسموتین پلی کلونال خرگوشی یا با آنتی‌سرم ضد eIF4A پلی کلونال خرگوشی که بعداً بوسیله پری اکسیداز درهم آمیخته ترب اسبی IgG ضدخرگوشی بز با آشکارسازی شیمیایی ـ تابشی با استفاده از عامل ECL انجام میشود. نمونه‌های RNA که به اندازه‌گیری آگارهای 2/1% تقسیم شدهاند و همینطور به ژل‌های فرمالوئید 25/18% در Mv75 به مدت 3 ساعت و به درون یک غشای نایلونی منتقل می‌شوند، آن هم با 10XSSC (2 مول NaCl و 1 مول سیترات سدیم و 1/0% SDS) به مدت 16 ساعت.
نتایج
تفاوت‌ها در محتویات آب نسبی و محتویات ABA در برگ‌های راسی و پایه‌ای در پاسخ به کمبود رطوبت پاسخ کمبود رطوبت خاک گیاهان تنباکوی رشد کرده در گلخانه در جفت برگ‌های کاملاً جدید باز شده (راسی) و جفت برگ‌های پیرتر (پایه‌ای) مورد آزمایش قرار گرفت. برگ‌های پایه‌ای هیچ نشانه‌ای از پیری را در اثر عملکرد کمی رطوبت از خود نشان ندادند و در خلال آزمایش گیاهانی که خوب آب خورده بودند، هم علامتی از پیری در آنها دیده نشد. .RWC جفت برگ‌های و پایه‌ای به ترتیب 4/1±2/76 و 2/2±7/80% بوده، آنهم تحت شرایط آبیاری نرمال و معمولی.
مقدار RWC برگ‌های پایه‌ای بعد از اعمال 96 ساعت کمبود آب به گیاه تا 9/1±1/48% کاهش یافت. مقدار REC برگ‌های راسی بعد از 96 ساعت کم‌آبی به 9/3±6/56%% کاهش یافت و حداقل پس از گذشت 48 ساعت دیگر در همان سطح باقی ماند. محتویات ABA در پاسخ به کمبود رطوبت در نمونه‌های برگی مشابه در 72 ساعت کاهش یافت و در زمانی که مقدار RWC به زیر 60% سقوط کرد، مقدار ABA افزایش یافت.
محتویات ABA برگ‌های راسی و پایه‌ای در هیچ نقطه زمانی تفاوت خاصی نداشت (P>0.1). وقتی که این گیاهان پس از 144 ساعت بعد از کمبود رطوبت و کم‌آبی مورد آبیاری مجدد قرار می‌گرفتند، برگ‌های راسی احیا می‌شوند، در حالی که برگ‌های پایه‌ای پیر می‌شوند. توانایی برگ‌های جوانتر برای باقی ماندن در RWC بالاتر آنهم در 96.144 ساعت کم‌آبی (به ترتیب P<0.25, P<0.05) نسبت به برگ‌های پایه‌ای مربوط به قدرت زندگی برگ‌های با سن مختلف میباشد.
انباشتگی متفاوت mRNA و پروتئین در برگ‌های راسی و پایه‌ای در خلال رشد و در پاسخ به کمبود رطوبت:
نسخه‌برداری و انباشتگی پیوسته mRNAی ltp، یعنی کدگذاری یک لیپید مشهور که پروتئین را منتقل می‌کند (ltp) در برگ‌های گیاه گوجه‌فرنگی بوسیله اعمال کمبود رطوبت خاک، تحریک می‌گردد. در تحقیق صورت گرفته توسط ما، فراوانی mRNAی ltp در پاسخ به کمبو رطوبت خاک در برگ‌های راسی تنباکو افزایش می‌یابد. سطوح mRNAی ltp در گوجه‌فرنگی بستگی به محتویات APAی برگ دارد. در تنباکو، یک رابطه قوی بین mRNAی ltp و محتویات APA در برگ‌های راسی و پایه‌ای دارد (به ترتیب 0.92, R2=0.99). انباشتگی mRNAی osm بر اساس توسعه، تنظیم میشود. در تنباکو بوسیله استرس کمبود رطوبت پیشرفت می‌کند و بوسیله APA تحریک میشود. سطوح mRNAی osm در برگ‌های راسی نسبت به برگ‌های پایه‌ای در زمان صفر پایین‌تر میباشد.
استرس کمبود رطوبت باعث پیشرفت یک افزایش در انباشتگی نسخه‌برداری در هر دو نمونه برگی میشود (تصویر 1ب). در مقابل این mRNAهای تحریک‌پذیر بوسیله ABA، سطوح mRNAی rbcS در برگ‌های راسی و پایه‌ای در خلال کمبود رطوبت کاهش می‌یابد. کاهش در این نسخه‌برداری در برگ‌های پایه‌ای بسیار سریعتر اتفاق می‌افتد. سطح پیوسته عامل آغازی اکاریوتیک mRNAی (elF4A) نیز در پاسخ به کاهش رطوبت کاهش می‌یابد. سطح این mRNA در برگ‌های پایه‌ای پایین‌تر از برگ‌های راسی بود. این اطلاعات مشخص می‌کند که فراوانی این چهار نسخه به صورت متمایز بوسیله توسعه و استرس کم رطوبتی تعدیل میشود.
فرمت این مقاله به صورت Word و با قابلیت ویرایش میباشد
تعداد صفحات این مقاله 13 صفحه
پس از پرداخت ، میتوانید مقاله را به صورت انلاین دانلود کنید
دانلود مقاله کنترل برگردان استنباط کمبود رطوبت در نیکوتیانا تاباکوم
خلاصه مقاله:
